2021
Metody wykrywania i oznaczania campylobacter w żywności
Najczęstsza przyczyna chorób odzwierzęcych
Bakterie z rodzaju Campylobacter od wielu lat są najczęstszą przyczyną zoonoz występujących w Europie. W Polsce kampylobakterioza jest chorobą rzadko diagnozowaną i rejestrowaną. Campylobacter spp. są szeroko rozpowszechnione w środowisku. Ich głównym rezerwuarem jest przewód pokarmowy ptaków i ssaków, w tym zwierząt hodowlanych. Drogi szerzenia się zakażenia u ludzi mogą mieć charakter bezpośredni, jak np. kontakt ze zwierzętami domowymi, hodowlanymi lub chorymi ludźmi oraz charakter pośredni (najczęściej) poprzez surowe lub niedogotowane mięso, zanieczyszczone mleko lub wodę. Duże znaczenie mają również zanieczyszczenia krzyżowe, występujące szczególnie w gospodarstwach domowych przy obróbce surowego mięsa drobiowego lub w środowisku szpitalnym na skutek nieodpowiedniej higieny rąk personelu. Jedną z przyczyn wysokiej zachorowalności na kampylobakteriozę jest niska dawka infekcyjna. Zachorowania występują sporadycznie. Epidemie pojawiają się rzadko i przeważnie związane są z mlekiem surowym lub wodą. Choroba ma postać zapalenia żołądkowo-jelitowego lub jelitowego. W jej przebiegu występują bóle brzucha, gorączka, biegunka i nudności. W rzadkich przypadkach w jej następstwie pojawiają się powikłania pozajelitowe: reumatologiczne lub neurologiczne. W Polsce w 2017 roku zarejestrowano 885 przypadków zachorowań na kampylobakreriozę.
Kampylobakterioza szerzy się m.in. poprzez spożycie surowego mięsa
Campylobacter w tuszach brojlerów
W 2017 roku weszło w życie Rozporządzenie Komisji (UE) 2017/1495 zmieniające rozporządzenie (WE) nr 2073/2005 w odniesieniu do obecności Campylobacter w tuszach brojlerów. Zmiana wprowadziła kryterium Campylobacter dla higieny procesu dla tusz drobiowych po schłodzeniu na poziomie 1000 jtk/g dla liczby próbek n=50 oraz liczby próbek niespełniających kryterium c=20. Od 2020 roku wartość c powinna już wynosić 15, a od 2025 roku 10. Jako referencyjną metodę badania wyznaczono metodę znormalizowaną EN ISO 10272-2. Analizowane są te same próbki, które wcześniej zostały pobrane do badania higieny procesu określonego dla Salmonella.
Norma ISO
Metodę znormalizowaną do wykrywania i oznaczania liczby Campylobacter w łańcuchu żywnościowym opisuje norma PN EN ISO10272 zeszyt 1 i 2. Ma ona zastosowanie do badania żywności i pasz oraz próbek środowiskowych z obszaru produkcji żywności i obrotu żywnością oraz próbek z obszaru produkcji pierwotnej, takich jak kał, kurz czy wymazy. Norma ta jest zwalidowana dla próbek o masie 10 g/10 ml. Należy pamiętać, że dla próbek o masie powyżej 10 g należy ją zweryfikować w warunkach laboratorium. Próbki przeznaczone do badań nie mogą być zamrażane, ponieważ Campylobacter jest wrażliwy na ujemne temperatury. Próbki powinny być przechowywane w warunkach chłodniczych i zabezpieczone przed wysychaniem. Wszystkie czynności należy wykonywać bardzo sprawnie, ponieważ Campylobacter do przeżycia wymaga atmosfery mikroaerofilnej.
Metoda wykrywania
Zeszyt 1 normy dotyczy metody wykrywania. W obrębie tej normy wyszczególniono 3 procedury, mające zastosowanie do różnych grup produktów. Zgodnie z procedurą A bada się produkty o niskim poziomie zanieczyszczenia bakteriami Campylobacter i niskim poziomie zanieczyszczenia mikroflorą towarzyszącą i/lub bakteriami narażonymi na niekorzystne warunki, jak np. w produktach gotowanych i mrożonych. Procedura B dotyczy produktów o niskim poziomie zanieczyszczenia Campylobacter i znaczącej ilości mikroflory towarzyszącej, jak surowe mięso czy mleko oraz gdy spodziewana jest mikroflora oporna na antybiotyki beta-laktamowe III generacji. Procedura C opisuje metodę wykrywania Campylobacter poprzez bezpośredni posiew na podłoże stałe – zgodnie z nią bada się produkty o wysokim poziomie zanieczyszczenia Campylobacter, jak mięso drobiowe, treść jelitową drobiu czy kał. Dobór procedury badawczej jest uzależniony od rodzaju próbki. W przypadku wątpliwości należy postępować zgodnie z procedurą C równolegle z procedurą A i/lub B.
Agar mCCD do hodowli Campylobacter
Metodyka oznaczania
Metodyka oznaczania Campylobacter składa się z kilku etapów. Zgodnie z procedurą A i B, badaną próbkę namnaża się wstępnie w bulionie. Dla procedury A jest to bulion Boltona, a dla procedury B bulion Prestona. W procedurze A inkubacja trwa 4-6 h w temp. 37°C , a następnie 40-48 h w temp. 41,5°C. w procedurze B zaś – 22-26 h w temp. 41,5 C. Wszystkie hodowle prowadzi się w warunkach mikroaerofilnych. Następny krok to posiew na pożywkę selektywną: dla A – agar mCCD oraz druga pożywka do wyboru; B i C – tylko pożywka mCCD i inkubacja przez 40-48h w temp. 41,5° C. Atmosferę mikroaerofilną uzyskuje się poprzez zastosowanie do hodowli słoi lub szczelnych woreczków z wkładami generującymi atmosferę o zmodyfikowanym składzie. Rekomenduje się wykonywanie posiewów równolegle ze szczepami kontrolnymi. Należy mieć na uwadze, że wyrosłe kolonie Campylobacter wykazują znaczną różnorodność. Badania potwierdzające tożsamość wyrosłych kolonii polegają na obserwacji cech morfologicznych (komórki posiadają charakterystyczny kształt spiralnie skręconych pałeczek) oraz ich zdolności do poruszania się – można zaobserwować ruch korkociągowy. Następnie wykonuje się test na obecność oksydazy przy użyciu komercyjnie dostępnych, wygodnych pasków OXI. Campylobacter to patogen oksydazododatni. W razie konieczności identyfikacji gatunkowej przeprowadza się wykrywanie katalazy oraz zdolności hydrolizy hipuranu i octanu indoksylu (testy dostępne w postaci gotowych zestawów odczynników).
Słój do hodowli w warunkach mikroaerofilnych
Badania potwierdzające
Zeszyt 2 normy PN EN ISO 10272 dotyczy metody oznaczania liczby Campylobacter. Badanie polega na bezpośrednim posiewie określonej objętości próbki płynnej/zawiesiny wyjściowej lub kolejnych dziesięciokrotnych rozcieńczeń na powierzchnię selektywnej pożywki mCCDA i inkubacji przez 40-48 h w temp. 41,5°C w warunkach mikroaerofilnych. Z płytek zawierających mniej niż 150 typowych lub przypuszczalnych kolonii oblicza się ich liczbę i na wybranych z każdej płytki pięciu koloniach przeprowadza się badania potwierdzające – takie same, jak w przypadku wykrywania obecności.
Pożywka chromogenna
Alternatywną metodą oznaczania liczby Campylobacter jest zastosowanie pożywki chromogennej np. Brilliance CampyCount. Jest to wysoko selektywna pożywka mająca w składzie kombinację soli (zastępujących węgiel lub krew stosowaną w tradycyjnych pożywkach), czynników wzrostowych, aminokwasów i buforów, dedykowana do oznaczania liczby C. jejuni i C. coli w drobiu. Płytki przed użyciem powinny być dokładnie wysuszone. Wyrosłe kolonie są ciemnoczerwone. Ze względu na prostotę wykonania i łatwość interpretacji wyniku metoda ta jest przyjazna dla użytkowników z małym doświadczeniem w badaniu Campylobacter.
Pożywka chromogenna Brillance CampyCount
Odróżnienie od innych bakterii Gram(-)
Potwierdzenia dokonuje się testem O.B.I.S. Campy. Służy on do odróżnienia Campylobacter spp. od innych Gram(-) mikroorganizmów. Jest to test szybki (wynik otrzymujemy już po kilku minutach), łatwy do wykonania bez dodatkowego wyposażenia oraz bardzo prosty w interpretacji – za sprawą wyraźnej zmiany kolorów. Test wykrywa aktywność L-alanino aminopeptydazy (L-ALA) – enzymu, którego Campylobacteriaceae nie posiadają. Zmiana koloru wyklucza Campylobacter.
Metody molekularne identyfikacji gatunkowej
W celu identyfikacji gatunkowej można posłużyć się metodami molekularnymi, które umożliwiają oznaczenie jakościowe oraz ilościowe. Ciekawym rozwiązaniem jest gotowy test Multiplex, działający na zasadzie Real Time PCR, umożliwiający ilościowe określenie trzech gatunków Campylobacter (C. jejuni, C. coli, C. lari) w jednym cyklu badań, trwającym 2,5 godziny. Ostateczny wynik uzyskuje się już po ok. 27 godzinach. Alternatywnym rozwiązaniem mogą być testy do oznaczania Capylobacter jejuni, opierające się na metodzie Real Time PCR, natomiast wymagające izolacji wysokiej jakości DNA. Stosując tę procedurę, końcowy wynik otrzymuje się po ok. 25 godzinach.
Test Multiplex PCR wykrywający trzy gatunki Campylobacter
Wykrywanie Campylobacter istotne dla przemysłu
Wszystkie wyżej wspomniane metody alternatywne pozwalają na wykrywanie lub oznaczanie liczby Campylobacter, w wielu rodzajach próbek, z coraz większą dokładnością, przy mniejszym nakładzie pracy i w krótszym czasie. Mając na uwadze, że zakażenie Campylobacter jest jedną z czterech głównych globalnych przyczyn chorób biegunkowych i jest uważane za najczęstszą przyczynę bakteryjnego zapalenia żołądka i jelit u ludzi, wykrywanie tej bakterii w produktach żywnościowych powinna być troską wszystkich producentów tej branży.
W załączonych materiałach znajdą Państwo dokładną specyfikację testów diagnostycznych, a także szczegóły dotyczące przedstawionych technik wykrywania oraz oznaczania liczby Campylobacter.
Autor: Dorota Merlak
