2024
Metoda ELISA w diagnozowaniu alergenów pokarmowych
Tydzień Bezpieczeństwa Żywności!
Metoda ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), charakteryzująca się wysoką czułością i specyficznością, jest jedną z najczęściej stosowanych technik analitycznych w wykrywaniu i ilościowym oznaczaniu alergenów w produktach spożywczych. Pierwsze zastosowanie metody ELISA opisali Engvall i Perlmann w 1971 roku, wprowadzając znakowane enzymatycznie przeciwciała do ilościowego oznaczania klasy immunoglobulin IgG. Procedura ta, przeprowadzana zwykle na 96-dołkowych płytkach polistyrenowych, opiera się na reakcji specyficznego antygenu z przeciwciałem, co prowadzi do powstania kompleksu immunologicznego. Wizualizacja tego związku następuje dzięki reakcji barwnej indukowanej przez enzymy sprzężone z przeciwciałami, z wykorzystaniem odpowiednich substratów.
Różnorodność metod ELISA
ELISA dzieli się na kilka odmian, które różnią się zastosowaniem i protokołem wykonania. Do głównych typów należą:
- ELISA bezpośrednia - antygen immobilizowany jest na płytce, a następnie wykrywany bezpośrednio przez przeciwciało znakowane enzymem.
- ELISA pośrednia - wykorzystuje dodatkowe przeciwciało wtórne znakowane enzymem, które wiąże się z przeciwciałem pierwotnym przyłączonym do antygenu.
- ELISA typu "sandwich" - antygen jest wykrywany między dwoma przeciwciałami, co zwiększa specyficzność i czułość metody.
- ELISA konkurencyjna - stosowana w przypadkach, gdy antygen jest zbyt mały, aby jednocześnie wiązać dwa przeciwciała; antygen w próbce konkuruje z antygenem na płytce o miejsce wiązania z przeciwciałem.
Protokół wykonania testu ELISA
Podstawowe etapy wykonania testu ELISA obejmują:
- Opłaszczenie fazy stałej - antygenem lub przeciwciałem, co pozwala na ich immobilizację na płytce.
- Blokowanie - zastosowanie albuminy surowicy bydlęcej (BSA) uniemożliwia nieselektywne wiązanie innych białek.
- Inkubacja z próbką - umożliwia powstanie kompleksu antygen-przeciwciało.
- Dodanie koniugatu - przeciwciało wyznakowane enzymem, np. peroksydazą chrzanową (HRP), wiąże się z antygenem lub przeciwciałem.
- Dodanie substratu - reakcja enzymatyczna prowadzi do zmiany barwy roztworu.
- Odczyt wyników - pomiar natężenia barwy za pomocą spektrofotometru, interpretacja ilości analitu na podstawie krzywej kalibracyjnej.
Kluczowe aspekty zapewnienia wiarygodności wyników
Zapewnienie wiarygodności wyników ELISA wymaga ścisłego przestrzegania protokołu i technik laboratoryjnych. Wymiana komponentów między różnymi zestawami jest niewskazana z powodu ryzyka wpływu na spójność wyników. Precyzyjne pipetowanie i odpowiednia kinetyka reakcji są kluczowe, podobnie jak kontrola temperatury i właściwe przechowywanie reagentów. Wszystkie etapy, od przygotowania próbki po odczytanie wyników, muszą być wykonane z należytą starannością, aby unikać błędów proceduralnych i zapewnić powtarzalność wyników.
Automatyzacja procesu
Automatyzacja ELISA poprzez systemy takie jak roboty laboratoryjne czy automatyczne stacje robocze znacząco przyczynia się do poprawy efektywności, redukcji błędów ludzkich oraz zwiększenia przepustowości testów. Współczesne laboratoria stosujące ELISA w dużej skali korzystają z automatyzacji, aby sprostać rosnącym wymaganiom diagnostycznym i badawczym w zakresie szybkiego i dokładnego wykrywania alergenów w różnorodnych próbkach.
W kontekście rosnącej potrzeby diagnostyki alergenów, metoda ELISA, z jej elastycznością, precyzją i możliwością automatyzacji, pozostaje kluczowym narzędziem w laboratoriach na całym świecie.
Autor:
Marta Koziel
Kierownik Produktu/ Dział Przemysł
Literatura:
- Shah K, Maghsoudlou P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. Br J Hosp Med (Lond). 2016 Jul;77(7):C98-101. doi: 10.12968/hmed.2016.77.7.C98. PMID: 27388394.
- Hosseini, Samira, et al. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): from A to Z. Singapore:: Springer, 2018.
- ROZPORZĄDZENIE PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I RADY (UE) NR 1169/2011 z dnia 25 października 2011 r. w sprawie przekazywania konsumentom informacji na temat żywności, zmiany rozporządzeń Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1924/2006 i (WE) nr 1925/2006 oraz uchylenia dyrektywy Komisji 87/250/EWG, dyrektywy Rady 90/496/EWG, dyrektywy Komisji 1999/10/WE, dyrektywy 2000/13/WE Parlamentu Europejskiego i Rady, dyrektyw Komisji 2002/67/WE i 2008/5/WE oraz rozporządzenia Komisji (WE) nr 608/2004
